液相色譜儀常見的基線問題有哪些

一、概述

色譜分析中基線噪音大、規(guī)律性波動(dòng)和漂移是比較常見的基線問題，這些異常的基線對(duì)方法的檢測(cè)靈敏度和雜質(zhì)組分的檢出能力具有很大影響，特別是在樣品純度測(cè)試以及痕量殘留物質(zhì)檢測(cè)中，異常的基線將會(huì)影響雜質(zhì)組分和痕量殘留物質(zhì)的定性和定量。

液相色譜中影響基線的因素很多，既會(huì)受到儀器硬件，如泵、混合器、燈能量和檢測(cè)器等影響，也會(huì)受到外界因素，如溫度、流動(dòng)相組成和使用添加劑等因素的影響。

二、液相色譜儀常見基線問題

1、單向閥對(duì)壓力波動(dòng)和基線的影響

采用液相色譜示差檢測(cè)器測(cè)定蜂蜜中糖含量的過程中偶爾會(huì)出現(xiàn)基線波動(dòng)異常的情況，并且伴隨著泵節(jié)奏發(fā)生改變，檢查發(fā)現(xiàn)儀器壓力波動(dòng)異常。

依據(jù)以往經(jīng)驗(yàn)首先懷疑是流動(dòng)相中有氣泡，于是停泵、對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行超聲脫氣，然而重新開泵時(shí)發(fā)現(xiàn)儀器壓力一直很小并且不斷波動(dòng)，運(yùn)行一段時(shí)間后，泵自動(dòng)停止運(yùn)轉(zhuǎn)并發(fā)出警報(bào)“lost prime”。

Purge管路中的氣泡，dry prime模式下用針筒抽取管路中的流動(dòng)相，此時(shí)發(fā)現(xiàn)沒有流動(dòng)相流出，于是意識(shí)到問題所在。由于采用的是流動(dòng)相在線混合的方式，其中一個(gè)通道走的是純乙腈，該儀器在用到純乙腈或高比例乙腈時(shí)單向閥經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)問題，據(jù)說該故障是由于乙腈發(fā)生交聯(lián)黏住單向閥中的寶石球引起的。于是根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，對(duì)單向閥進(jìn)行拆卸并超聲清洗。

拆卸單向閥時(shí)，由于重力作用流動(dòng)相會(huì)不斷流出（平時(shí)使用時(shí)流動(dòng)相放于儀器的上端），要阻止流動(dòng)相的流動(dòng)有兩種方法，

（1）直接將管路從流動(dòng)相瓶中拿出來，但是也會(huì)有少量殘余的液體流出；

（2）關(guān)閉GPV（梯度比例閥）。關(guān)閉GPV之后就可以拆卸單向閥了，首先明確儀器有幾個(gè)單向閥，任何一個(gè)單向閥有問題都會(huì)引起壓力波動(dòng)，因此最好同時(shí)進(jìn)行清洗。

單向閥清洗流程：先將單向閥用5％左右硝酸溶液超聲15~30min，然后換用純水超聲15~30min，最后換用甲醇超聲15~30min，如果時(shí)間充裕，多超聲一會(huì)也無妨。

清洗、安裝好單向閥（安裝時(shí)兩個(gè)單向閥的箭頭均朝上）后再次在dry prime模式下用針筒抽取管路中的流動(dòng)相，排除氣泡。排氣結(jié)束后重新啟動(dòng)泵，儀器壓力逐漸變大，系統(tǒng)壓力波動(dòng)恢復(fù)到允許的范圍內(nèi)，走基線和測(cè)定時(shí)基線波動(dòng)有所改善。

2、參數(shù)設(shè)置對(duì)基線的影響

有些儀器能夠通過修改靈敏度或者增益等參數(shù)影響色譜圖的基線和信號(hào)響應(yīng)。有的液相色譜儀示差檢測(cè)器就有這樣的功能，其靈敏度有1~1024共11種選項(xiàng)，同樣以蜂蜜中糖含量測(cè)定為例，選擇低、中、高3種模式進(jìn)行測(cè)定，考察靈敏度對(duì)基線噪音的影響。

對(duì)比不同靈敏度模式下測(cè)定的色譜圖、基線噪音和壓力波動(dòng)可以發(fā)現(xiàn)，靈敏度對(duì)色譜峰的響應(yīng)值和基線噪音有很大的影響，靈敏度越大，色譜峰響應(yīng)值越高，同時(shí)基線噪音也越大。

當(dāng)靈敏度由4變?yōu)?28時(shí)，果糖的響應(yīng)值也由60MV增加到2000MV，同時(shí)基線噪音由2MV左右增加到50MV左右。從壓力波動(dòng)的圖中可以發(fā)現(xiàn)，靈敏度的改變對(duì)壓力波動(dòng)幾乎沒有影響，不同靈敏度模式下壓力波動(dòng)范圍均維持在20psi左右，可見壓力并不是此次噪音增大的主要因素。

3、流動(dòng)相混合方式對(duì)基線的影響

通常液相色譜儀配置高壓二元泵或者低壓四元泵，而泵的沖程體積以及混合器（二元高壓泵）的體積大小均會(huì)對(duì)色譜基線噪音產(chǎn)生影響，泵的沖程體積越小以及混合器的體積越大，由輸液造成的脈沖相對(duì)越小，基線越平穩(wěn)。

示差檢測(cè)器是連續(xù)檢測(cè)樣品池和參比池間液體折光指數(shù)差值的檢測(cè)器，該檢測(cè)器對(duì)流動(dòng)相的變化和溫度都很敏感，流動(dòng)相通過比例閥進(jìn)行在線混合可能導(dǎo)致流動(dòng)相混合不均勻引起液體折光率產(chǎn)生微弱差異，同時(shí)乙腈與水的在線混合也可能引起溫度的變化。

采用單泵預(yù)混的方式可以避免上述問題，因此使用示差檢測(cè)器時(shí)，如果流動(dòng)相需要用混合溶劑，建議先將流動(dòng)相進(jìn)行預(yù)混，并采用單一流路的方式運(yùn)行。實(shí)踐證明，采用流動(dòng)相預(yù)混和單一流路的方式基本消除了測(cè)糖過程中的基線波動(dòng)現(xiàn)象。

4、氘燈對(duì)基線的影響

氘燈是紫外檢測(cè)器中非常重要的光學(xué)部件，在生產(chǎn)初期就被廠家賦予了一定的生命值，其設(shè)計(jì)使用時(shí)間有500、1000，2000小時(shí)等等。當(dāng)氘燈使用時(shí)間超過設(shè)計(jì)使用時(shí)間后就可能出現(xiàn)氘燈能量下降、基線漂移和噪音增大等現(xiàn)象。因此如果實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)基線漂移和噪音增大的情況，有必要去檢查一下氘燈的使用時(shí)間和氘燈能量。

5、流通池污染對(duì)基線的影響

通過一系列的排查，排除掉單向閥、色譜柱、流動(dòng)相和氘燈等因素，最后檢查流通池。首先實(shí)驗(yàn)室要有兩臺(tái)相同型號(hào)的檢測(cè)器，在確保另外一臺(tái)設(shè)備完好的情況下將流通池進(jìn)行調(diào)換，調(diào)換后發(fā)現(xiàn)，原先有故障的設(shè)備恢復(fù)了正常，相反，原來正常的設(shè)備基線噪音變大，從而表明流通池出了問題。對(duì)流通池進(jìn)行清洗，清洗之后基線恢復(fù)了正常（操作指南上有流通池的清洗步驟）。

6、流動(dòng)相對(duì)基線的影響

高效液相色譜儀在測(cè)定之前通常需要對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行切換，尤其用到緩沖鹽時(shí)需要用高比例的水相先進(jìn)行過渡，然后再用流動(dòng)相平衡色譜柱，如果測(cè)定時(shí)操之過急，色譜柱未完全平衡就進(jìn)行測(cè)定容易出現(xiàn)基線不同程度的漂移。

流動(dòng)相對(duì)基線噪音的影響因素很多，例如氣泡、污染物、添加劑、緩沖鹽等，都可能導(dǎo)致基線噪音增大或者基線的漂移。

7、反壓（又叫背壓）對(duì)基線的影響

高效液相色譜儀的系統(tǒng)壓力較高，色譜柱是產(chǎn)生系統(tǒng)壓力的主要部件，流動(dòng)相流過色譜柱和檢測(cè)器之后壓力迅速下降會(huì)使流通池中產(chǎn)生氣泡，從而影響基線。反壓抑制器能夠減緩流動(dòng)相流出流通池時(shí)的壓力下降程度，防止流通池中產(chǎn)生氣泡。有些儀器是在檢測(cè)器后面加上一段比較細(xì)的管路，還有些儀器是在檢測(cè)器后面加上一個(gè)反壓抑制器，通過較細(xì)的管路或者反壓抑制器對(duì)檢測(cè)器形成一定的反壓。不合適的反壓也會(huì)對(duì)儀器或者基線產(chǎn)生一定的影響，反壓太高超過流通池的耐受壓力，會(huì)導(dǎo)致流通池的損壞；反壓不夠流通池中容易產(chǎn)生氣泡，影響基線。

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