水產品獸藥殘留檢測方法及能力驗證詳細說明

一、水產品獸藥殘留檢測方法

獸藥殘留（animal drug residues）是指給動物使用藥物后蓄積或貯存在細胞、組織或器官內的藥物原形、代謝產物和藥物雜質。近10年來，水產品中獸藥殘留問題引起了社會的廣泛關注，也經歷了貿易壁壘的多發期，直接影響著中國水產行業的轉型和升級。在水產品養殖過程中，非法使用違禁藥物、不遵守休藥期、生物體代謝差異和不合理用藥等都有可能導致獸藥殘留超標。

獸藥殘留分析的檢測手段多樣，酶聯免疫試劑盒、膠體金免疫試紙條和熒光試紙條等快速檢測產品能夠實現高通量、快速篩選，其靈敏度、準確性和時效性正在不斷優化和革新；氣相色譜儀、液相色譜儀、氣相色譜-質譜儀、液相色譜-串聯質譜儀和高分辨質譜等儀器是實驗室常用的分析設備，具有定量準確、準確度更高等優點，特別是具有高靈敏度、高分辨率的質譜儀，是進行陽性樣品確證分析的首選。

1、硝基呋喃類代謝物檢測方法

硝基呋喃類藥物是一類化學合成的廣譜抗菌藥物，常見的有呋喃唑酮(furazolidone，FZD)、呋喃西林(nitrofurazone，NFZ)、呋喃妥因(nitrofurantion，NFT)和呋喃它酮(furaltadone，FTD)，曾廣泛用于畜禽、水產等動物傳染病的預防與治療。硝基呋喃類藥物原藥及其代謝產物具有一定的毒性，有致畸、致突變和致癌的危險。出于安全性考慮，自1993年開始，歐盟、美國等發達國家和地區先后頒布了禁止使用該類獸藥的禁令。中國于2002年頒布的農業部第193號公告《食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單》，明確禁止使用硝基呋喃類廣譜抗菌藥物。但是由于硝基呋喃類藥物價格低廉、療效好，在水產養殖中仍存在違禁使用的現象，在近幾年開展的水產品風險隱患排查工作中屢有檢出。

硝基呋喃類藥物在生物體內代謝迅速，很難檢測到原藥，因此標準方法都是對其代謝產物進行測定，表1中列出了當前適用于水產品中硝基呋喃代謝物殘留測定的方法標準，均采用液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)進行測定，其中農業部783號公告-1-2006是中國水產品質量安全監控的推薦方法，該方法的適用范圍廣、定量準確、靈敏度高，是常用的檢測方法。

表1 水產品中硝基呋喃代謝物殘留測定方法標準

2、孔雀石綠檢測方法

孔雀石綠（malachite green, MG）作為一種三苯甲烷類染料，曾廣泛用作水產養殖業中的驅蟲劑和殺菌劑，以防治魚類水霉病、鰓霉病、及小瓜蟲病等，是一類抗菌效力較強的藥用染料。然而，MG不僅在生物體內有明顯蓄積現象，且迅速被代謝成隱色孔雀石綠(leucomalachite green, LMG)。在魚體內和環境中殘留時間長，具有潛在的“三致”作用，因此包括中國在內的許多國家都禁止其在水產養殖中使用。但是由于MG抗菌效果較好，價格低廉且無有效替代藥物等原因，在近幾年的監控工作中發現MG仍在個別水產品種的養殖中違規使用。

表2是水產品中MG殘留測定常用的方法標準，GB/T 19857—2005 (第一法）和GB/T 20361—2006的檢測結果相近，差異不顯著，可根據實驗室情況自行選擇。但是與液相色譜法（LC）相比，LC-MS/MS前處理操作相對簡單，定性方式更準確，是進行陽性樣品確證的必要方法，也是農業部水產品質量安全監控的首選方法。

表2 水產品中孔雀石綠殘留標準測定方法

3、 氯霉素檢測方法

氯霉素(chloramphenicol，CAP)是1947年首次從委內瑞拉鏈絲菌的培養液中提取而得到的抗生素，具有廣譜抗菌作用，對多數G+、G-菌均有效，在水產養殖中能有效防治爛鰓、赤皮病。CAP對人類的毒性較大，可抑制骨髓造血機能、造成過敏反應，引起不可逆的再生性障礙貧血等。

美國、日本、韓國和歐盟等國家和地區均已禁止在食用性動物中使用氯霉素，并規定在動物源性食品中不得檢出。中國農業部在2002年12月第235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中規定CAP為禁用藥物，在動物性食品中不得檢出［6］。目前，CAP是中國水產品質量安全監管的對象之一，其抑菌效果優于其替代藥物，近年來在大宗水產品中的檢出率不高，但是帶入途徑復雜，仍是目前監控的重點。

水產品中CAP殘留量的測定方法很多，包括酶標法、氣相色譜法（GC）、氣相色譜-質譜聯用法（GC-MS）和LC-MS/MS等（表3）。其中酶標法用于CAP的快速篩查測定，氣相色譜法可以用于CAP的準確定量測定， LC-MS/MS和GC-MS法均可以作為CAP殘留的確證方法，在對陽性樣品的測定中，可以互為補充。

表3 水產品中氯霉素殘留標準測定方法

4、磺胺類

磺胺類藥物（sulfonamides, SAs）是對氨基苯磺酰胺結構的一類藥物的總稱，主要用于預防和治療細菌感染性疾病。在水產養殖中主要用于治療魚、蝦、蟹、鱉等動物的細菌性疾病，防治鯉的赤鰭病，香魚、虹鱒等的弧菌病等。由于SAs在生物體內的作用時間和代謝時間較長，蓄積濃度超過一定值會對人體健康造成危害，導致很多細菌對SAs產生抗藥性［1］。

因此，許多國家都對SAs的使用限量進行了規定，歐盟規定肉類食品中磺胺類藥物的最高殘留限量(MRL)為：單一SAs藥物≤25 μg/kg，SAs總量≤100 μg/kg；日本肯定列表規定動物源性食品中單一SAs0.01~0.1 mg/kg，其中水產品為0.1 mg/kg；國際食品法典委員會與中國農業部235號公告中均規定動物組織中SAs藥物的MRL為100 μg/kg。

表4是水產品中磺胺類藥物殘留測定的方法標準，其中農業部958號公告-12-2007和農業部1077號公告-1-2008是常用的檢測方法，農業部958號公告-12-2007前處理繁瑣，回收率稍低，靈敏度基本能夠滿足限量要求；農業部1077號公告-1-2008方法簡便快捷，靈敏度高，可以用于磺胺類藥物的陽性確證。

表4 水產品中磺胺類殘留標準測定方法

二、水產品獸藥殘留檢測能力驗證

    能力驗證(proficiencytesting)也稱能力驗證計劃，是通過實驗室間測試結果的比對來判定實驗室能力的合格評定活動。近年來，農業部組織開展了水產品中藥物殘留、重金屬及貝類毒素等3大方面檢測能力驗證，涉及的能力驗證考核參數包括氯霉素、孔雀石綠、鎘、鉛、麻痹性貝類毒素等20多項，有力地促進了質檢機構的運行和管理，提升了檢測人員的技術水平。

目前，獸藥殘留測定是進行水產品質量安全監控的主要手段，氯霉素、孔雀石綠和硝基呋喃等禁用藥物是藥物殘留監控的重點，為了確保水產品的質量安全，氟甲砜霉素、甲砜霉素、磺胺類和喹諾酮類等限用藥物也早已納入監控工作。但是由于各個實驗室間的檢驗能力良莠不齊，有時會對檢驗數據的可靠性存在質疑，影響了監控工作的權威性，因此監管部門將能力驗證作為檢驗實驗室能力水平的一個主要的方式。

能力驗證（proficiency testing）是通過實驗室間比對，按照預先制定的準則來判定實驗室能力的活動。能力驗證是實驗室認可機構加入和維持國際相互承認協議（mutual recognition agreement, MRA）的必要條件之一，也是實驗室進行自我評價的手段［2］。中國農產品能力驗證考核始于2003年，雖然起步較晚，但是實驗室能力驗證的方法標準均參考國外權威機構的標準制定，10多年來技術能力取得了長足的進步。能力驗證在檢測實驗室的覆蓋率逐年增加，監管部門通過組織能力驗證，可以了解實驗室是否有能力勝任所從事的監控工作；實驗室通過參加能力驗證，了解自身能力，將其作為內部質量控制的補充措施，滿足持續改進的要求。

根據能力驗證活動的要求，選擇正確的檢測方法標準，掌握檢測方法的操作要領和關鍵點，減少方法對檢測結果的影響是確保順利通過能力驗證工作的關鍵。在此基礎上，還建議采取做好準備工作，提高檢測能力，保證質量控制措施到位，以及對檢測數據進行正確的修約等如下保障措施，減少不滿意結果的產生。

對做好水產品獸藥殘留檢測技術能力驗證工作，特提出以下建議：

1、提前練習

按規定的標準操作程序或作業指導書進行操作，熟練掌握方法的前處理過程，并能重現方法的靈敏度和準確度。

2、 標準溶液核查

根據標準要求重新配置標準貯備液或購置有證標準溶液，并與在用標準溶液進行核對，保證標準溶液的有效性。

3、 考核樣品的處理

檢查編號是否準確，包裝是否完整、無破損，按照通知要求進行保存。嚴禁用微波等加熱方式對樣品解凍，應在室溫下自然解凍后再進行前處理。樣品前處理過程中，應盡量避光操作。

4、做好質量控制

質量控制中應包括空白實驗(包括試劑空白和對應的基質空白)和控制樣品（檢出限加標、3~10倍檢出限加標），與考核樣品同時測定。空白實驗可確保空白值在控制限內，避免測試過程中的污染和空白基質中的干擾。控制樣品的有效性可確保測試結果的靈敏度和準確度。

5、 檢測結果的判斷

在進行檢測結果計算時，首先應考察校準曲線是否滿足要求，其次是平行樣的測定結果是否在相對偏差范圍內，然后是質控樣品的準確度和靈敏度是否符合標準要求，還要進行不確定度的計算。對于偏差較大的數據，可以采用統計學方法進行測算，如平均值的置信區間等。

（內容參考食典報）